Confocal single molecule FRET studies of surface immobilized biomolecules

Albarghash, Alyazan; Fitter, Jörg Ludwig (Thesis advisor); von Plessen, Gero (Thesis advisor)

Aachen (2018, 2019)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Einzelmolekül-FRET ist eine leistungsfähige, vielseitige Methode, die neben der Strukturbestimmung von biologischen Makromolekülen auch die Beobachtung der molekularen Konformationsdynamik ermöglicht. Sie liefert wertvolle Erkenntnisse, die unser Verständnis von Faltungsphänomenen und anderen biologischen Prozessen wie der Ligandenbindungskinetik verbessern. FRET kann mit frei in Lösung diffundierenden Molekülen durchgeführt werden. Dabei liegen die die Beobachtungszeiten typischerweise im Millisekundenbereich beschränkt durch die kurze Verweilzeit der thermisch durch das Detektionsvolumen getriebenen Moleküle. Um die Beobachtungszeit von FRET-Messungen zu verlängern, ist die Immobilisierung der Moleküle auf funktionalmodifizierten Oberflächen ein gut etabliertes Verfahren. In dieser Arbeit wird ein verbessertes Protokoll zur Oberflächenimmobilisierung basierend auf dem Biotin-Neutravidin-Bindungsassay vorgestellt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Einzelmolekül-FRET-Messungen unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen. Die Beobachtungszeit der verankerten Moleküle ist dabei durch die Photostabilität der gewählten Fluorophore begrenzt. Daher wurden die photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore Alexa488 und Alexa647, die in dieser Arbeit als FRET-Paar ausgewählt wurden, untersucht. Die Auswirkung verschiedener Klassen von sogenannten Photoprotektionsadditive auf das photophysikalische Verhalten des gewählten FRET-Paares wurde in Bezug auf die Emissionslebensdauer und Signalstabilität untersucht. Ein Protokoll zur Verbesserung der FRET-Paar-Photostabilität in wässrigen Puffern, auch in Gegenwart von Denaturierungsmitteln wurde etabliert. Zwei verschiedene starre, doppelsträngige DNA-Oligonukleotiden mit definierten Abständen zwischen den Farbstoffbindepositionen wurden als Modellsystem für einstufiges FRET verwendet, um die Wirkung der angepassten experimentellen Bedingungen auf die Ergebnisse der FRET-Messung zu untersuchen. Zusätzlich wurde dynamisches FRET am Beispiel der Phosphoglyceratkinase (PGK) in nativen Zustand und in Gegenwart des Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid (GdnHCl) untersucht. Die FRET-Messungen wurden mit einer konfokalen Mikroskopie-Anlage durchgeführt, welche die Auflösung der Fluoreszenzlebensdauern und so die genaue Bestimmung der FRET-Effizienzen ermöglicht. Die Ergebnisse der Fluoreszenzlebensdaueranalyse trugen entscheidend zum Verständnis der FRET-Prozesse sowie der damit verbundenen photophysikalischen Phänomene bei. Die Kalibrierungsparameter, welche für die verschiedenen Detektionseffizienzen der verschiedenen Detektionskanälen korrigieren, wurden für die jeweiligen experimentellen Bedingungen genau bestimmt. Schließlich zeigte die Fluoreszenzlebensdaueranalyse der Donoremission nach Photobleichen des Akzeptors die Existenz zweier möglicher Dunkelzustände des Akzeptors, von denen einer Löschwirkung auf den Donor entfaltet.