Translation initiation with 70S ribosomes : a single molecule study

  • Translationsinitiierung mit 70S Ribosomen. Eine Einzelmolekuelstudie

Remeş, Cristina; Fitter, Jörg Ludwig (Thesis advisor); Müller, Frank (Thesis advisor)

Aachen (2017, 2018)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Bisher wurden in der Literatur drei Initiierungswege für die Proteinsynthese beschrieben: der 30SBindungsmechanismus der kanonischen mRNAs, welcher als ersten Schritt die Bindung der kleinen Untereinheit an das Startkodon mittels Initiierungsfaktoren annimmt, die seltene Initiierung von mRNAs ohne Leadersequenz durch 70S Ribosomen, und der 70S-Scanning Initiierungsmodus, bei dem das zweite Cistron einer polycistronischen mRNA durch Translation übersetzt wird. Das Standardmodell aus dem klassischen Lehrbuch nimmt an, dass Translation der kanonischen mRNAs ausschließlich über den 30S-Bindungsmechanismus abläuft. Dieser Mechanismus setzt die Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten voraus. Im Gegensatz dazu zeigen wir hier in einem in vitro Transkription-Translationssystem, dass Translation der kanonischen mRNAs auch durch vollständige 70S Ribosomen initiiert werden kann, ohne Dissoziation der Untereinheiten. Die Initiierungsereignisse, die nach dem klassischen und nicht-klassischen Modell abgelaufen sind, wurden quantitativ durch Einzelmolekülexperimente untersucht. Einzelmoleküluntersuchungen sind für diese Studie ausschlaggebend, da es für die Identifizierung und Quantifizierung der möglichen Initiierungswege unbedingt erforderlich ist, einzelne Moleküle zeitlich verfolgen zu können. Um für die Studie erforderlichen Einzelmolekülexperimente durchführen zu können, musste zunächst der Prozess der Probenvorbereitung optimiert werden. Dafür wurden die Protokolle für die Reassoziation, für die Biotinylierung und für die Markierung der Ribosomen etabliert. Die Reassoziationsprozedur besteht dabei aus der Herauslösung der fest gekoppelten 70S aus E. coli, der nachfolgenden Dissoziation in Untereinheiten und anschließenden Bildung von 70S Monosomen durch Reassoziation der Untereinheiten. Diese Prozedur liefert Ribosomen von sehr hoher Reinheit, ohne bakterieneigene mRNAs und andere Faktoren. Bei der Biotinylierungsprozedur werden zwei Wege vorgestellt: zum einen, die in vivo Biotinylierung des ribosomalen uL4 Proteins und zum anderen, die Kopplung eines biotinylierten Oligonukleotiden an eine RNA Schleife, die an die kleine Untereinheit der Ribosomen angebracht wurde. Die in vivo Biotinylierung führt zur Senkung der Aktivität der modifizierten Ribosomen um 25%, im Gegensatz zum zweiten Ansatz, der die Aktivität der Ribosomen unbeeinträchtigt lässt. Zur Durchführung der Einzelmoleküluntersuchungen müssen die Ribosomen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Hierfür wurden zwei Methoden gewählt: einerseits die ortsunspezifische Markierung der zugänglichen Lysine mit NHS-Ester Farbstoffen und die ortspezifische Markierung durch Bindung von Farbstoff gekoppelten Oligonucleotiden an die hergestellten rRNA Schleifen. Die fluoreszent markierten Ribosomen wurden für beide Szenarien untersucht, und ihr Markierungsanteil, das Vorhandensein von Aggregaten und von freiem Farbstoff, und das Niveau der ribosomalen Aktivität wurden gemessen. Die erste Methode ermöglichte die multiple Markierung von Ribosomen, allerdings wurde ein Abfall der ribosomalen Aktivität um 1/3 ihres Wertes im Originalzustand ohne Markierung beobachtet. Die zweite Methode ermöglichte die ortsspezifische Einzelmarkierung der Ribosomen, die ein mit dem unmarkierten Zustand vergleichbares Aktivitätsniveau zeigen. Der zweite Schritt beinhaltete die Verbesserung der Fixierungseigenschaft der DNA, die für GFPem Synthese verwendet wurde. Eine unzureichende Fixierung hätte eine Freisetzung der GFPem aus dem ribosomalen Komplex zur Folge, so dass es nicht mehr im Zusammenhang mit dem synthetisierenden Ribosom im Weitfeldmikroskop gemessen werden könnte. Darüber hinaus könnten sich die ribosomalen Untereinheiten trennen, was bedeuten würde, dass jene 70S Ribosomen, die möglicherweise eine Translation initiierten, als solche nicht mehr erkannt werden könnten. Frühere Arbeiten verwendeten eine Sekretionsmonitor-Fixierungssequenz (SecM), um ribosomale Elongationsketten zu halten. Allerdings offenbarte SecM in unseren Experimenten eine unbefriedigende Fixierungseigenschaft, da sich das Groteil von hergestellten Proteinen von Ribosomen loslösen konnte. Es wurde daher eine neue SecM Fixierungssequenz (SecMstr) entworfen, die Fixierungseffizienz stark steigern konnte - sie zeigte eine fast vollständige Fixierung von Ribosomen (>95%). Die hohe Fixierungseffizienz erlaubte auch die Quantifizierung des Anteils der aktiven Ribosomen in einem in vitro Transkription-Translationssystem. Dort wurde ebenfalls die mittlere Zahl der produktiven Synthesezyklen ermittelt, die Ribosomen unter diesen Bedingungen ausführen konnten. Weiterhin wurden die spektroskopischen Methoden für die Einzelmoleküluntersuchungen optimiert. Um das Ausbleichen und das Blinken der Fluorophoren zu vermindern, wurden zwei Sauerstoffszehrungssysteme untersucht: das Protocatechusäure/Protocatechuat-3,4-Dioxygenase (PCA/PCD) System in Kombination mit Trolox, und die Glukose Oxydase / Katalase (Gox) System. Das erste System verbessert stark die Photostabilität von Cy5, sowohl in Zweifarben-Koinzidenzdetektion (Two-Colour Coincidence Detection, TCCD) als auch in Weitfeldmessungen. Für die spezifische Fixierung der biotinylisierten Ribosomen auf modifizierten Glasdeckgläsern wurde ein Protokol zur Beschichtung der Deckgläser mit einer Mischung aus PEG und bioPEG entworfen. Besonderer Fokus lag dabei auf einem niedrigen Niveau des Fluoreszenzhintergrundes, der Herstellung von einer guten spezifischen Bindung und der Fähigkeit, die fixierten Ribosomen aktiv zu halten. Nach der Optimierung des gesamten Verfahrens wurde die Studie zur Translationsinitiierung durchgeführt. Dabei wurden Ribosomen mit ortsspezifischen fluoreszenten Einzelmarkierungen verwendet. Kanonische mRNA mit integrierter SecMstr Sequenz wurden dabei eingesetzt, um hergestellte GFPem Moleküle an Ribosomen gebunden zu halten. Die verschiedenen Initiierungswege wurden durch TCCD Experimente quantifiziert. Es hat sich gezeigt, dass aus der Gesamtzahl der erfolgreichen Translationen 30% auf die Initiierung mit 70S, und 70% auf die Initiierung durch 30S-Bindung fielen. Die hier vorgestellte Studie ist somit die erste, welche Initiierung der kanonischen mRNAs durch vollständige 70S Ribosomen, die nicht in Untereinheiten dissoziieren, bestätigt und quantifiziert hat. Das optimierte System kann im weiteren Verlauf für die Untersuchungen mit Weitfeldmikroskopie verwendet werden, um noch mehr Einsicht in die Dynamik der Prozesse liefern, die dem Initiierungsmechanismus der 70S Ribosomen zugrunde liegen. Außerdem bietet die optimierte SecM Fixierungssequenz in Kombination mit Einzelmolekülmessungen ein breites Spektrum an weiteren Studien der Transkription, Translation und der co-translationalen Proteinfaltung.

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