Structural and dynamical properties in protein ligand interactions

• Strukturelle und dynamische Eigenschaften von Protein Liganden Interaktionen

Sarter, Mona; Fitter, Jörg (Thesis advisor); Stadler, Andreas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

In dieser Arbeit wurden strukturelle und dynamische Eigenschaften von Protein-Liganden-Interaktionen analysiert. Dies wurde hauptsächlich durch Streutechniken gemacht. Neben den Streutechniken wurden ergänzende Techniken benutzt. Die hauptsächlich benutzte Streutechnik war die inkohärente Neutronenstreuung, da diese eine Analyse des Proteins unabhängig von der Hydrathülle erlaubt. Zwei Protein-Liganden Systeme wurden untersucht. Das erste war das Protein Streptavidin (STV) und sein Ligand Biotin (B). Zusätzlich hierzu wurde ein gentechnisch hergestellter Förster resonance energy transfer (FRET) basierter Glukose Sensor mit und ohne hinzugefügter Glukose untersucht. Für die ausgewählten Systeme war die besondere Herausforderung die Einflüsse der Hydrathülle und des Proteins zu trennen. Ebenso war es herausfordernd Modelle zu finden, um aus all diesen separaten Beobachtungen eine zusammenhängende Interpretation zu formen. Um das STV Protein unabhängig von der Hydrahülle zu betrachten wurde Neutronenstreuung als die angemessene Technik gewählt, während für den Glukosesensor die strukturellen Änderungen als die wichtigste zu erhaltende Information eingestuft wurden und daher Röntgenstreuung benutzt wurde. Für die STV+B Interaktion wurde berücksichtigt, dass die molekulare Dynamik eine wichtige Rolle für die biologische Funktion von Proteinen spielt. In dem Fall von Protein Liganden Interaktionen sind Änderungen der Konformationsentropie des Proteins und der Hydrathülle für den Bindeprozess besonders wichtig. Hier wurde dies für STV+B untersucht, ebenso wie die Änderung der internen Dynamik von STV durch die Biotin Bindung. Quasi-elastische Neutronenstreuung (QENS) wurde verwendet um die Änderungen der Konformationsentropie des Proteins und seine Dynamik zu untersuchen. QENS Ergebnisse zeigen, dass die Konformationsentropie von STV nach Biotinbindung reduziert ist. TDFRS Ergebnisse weisen außerdem auf eine gesteigerte Entropie der Hydrathülle hin. Dies signalisiert, dass die Hydrathülle eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Bindung von Biotin an STV spielt. Vergleiche der Änderung der Konformationsentropie pro Residuum mit anderen biologischen Prozessen zeigten, dass der STV+B Bindungsprozess eine vergleichbare Änderung hat wie der Übergang von dem molten globule Zuständen zu der gefalteten Struktur von Myoglobin. Vergleiche zu anderen Protein-Liganden Bindungen zeigten, dass die Änderung der Konformationsentropie eine Größenordnung größer ist. Dies weist darauf hin, dass innerhalb von STV eine signifikante Änderung der Konformationsentropie erfolgt, größer, als die durch das bekannte Schließen der Bindungstasche erwartete. Die interne Dynamik von STV vor und nach der Bindung von Biotin wurde verglichen. Dies zeigte, dass die Flexibilität von STV durch die Bindung von Biotin deutlich reduziert ist und der Komplex rigider ist. Das zweite untersuchte System waren genetisch hergestellte FRET basierte Biosensoren, die entwickelt wurden um Metabolite in Nährlösungen für lebende Zellen zumessen. Die Sensoren bestehen aus einem zentralen Metaboliten bindenden Protein und sind von fluoreszenten Proteinen (FP) umgeben, die mit unterschiedlichen Verbindungssequenzen fixiert sind. FRET Messungen reagieren sowohl auf Änderungen von Abständen, als auch von Orientierungen der FP Domänen empfindlich, welche als Reaktion auf die Glucosebindung auftreten. Size-exclusion chromatograpy - small-angle X-ray scattering (SEC-SAXS) Messungen wurden durchgeführt um zu untersuchen, ob entweder große strukturelle Änderungen der FP Positionen zueinander, oder relative Änderungen der Orientierung zueinander als Reaktion auf die Bindung von Glucose vorkommen. Basierend auf den gemessenen SAXS Kurven wurden Modellierungen der FP Domänen Position vorgenommen. Es wurde festgestellt, dass Glucosebindung zu großen strukturellen Änderungen der Positionen der FPs für einen der Sensoren führt. Diese Strukturen passen zu dem aufgrund von Fluoreszenzmessungen erwartetem Verhalten des Sensors. Dies wurde erreicht indem die einzelnen Einflüsse separiert wurden, durch Nutzung der Empfindlichkeit von Neutronen auf die unterschiedlichen Streuquerschnitten von unterschiedlichen Wasserstoff Isotopen. Zusätzlich wurden kalorimetrische Techniken und TDFRS benutzt um die für das STV system erhaltenen Neutronendaten zu unterstützen. In dem Fall des Glukosesensors wurden SAXS und FRET Daten kombiniert.