Single-Molecule characterization of FRET-based biosensors and development of Two-Color coincidence detection

Höfig, Henning; Fitter, Jörg (Thesis advisor); Wöll, Dominik (Thesis advisor)

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralbibliothek, Verlag (2020)
Buch, Doktorarbeit

In: Schriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Schlüsseltechnologien/ key technologies 225
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XVIII, 160 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Biomoleküle zeigen oft heterogene Eigenschaften wie z. B. verschiedene Konformationszustände. Ensemblemessungen können die zugrunde liegende Heterogenität nicht auflösen, da sie nur gemittelte Werte liefern können. Im Gegensatz dazu, erlauben Einzelmolekülmessungen diese Heterogenität offenzulegen, da sie auf der Analyse von Molekül für Molekül basieren. In der vorliegenden Arbeit werden zwei Anwendungen von Einzelmolekülmessungen, die auf der Konfokaldetektion von Fluoreszenzmarkierten Biomolekülen basieren, vorgestellt. Zunächst werden genetisch kodierbare FRET-basierte Biosensoren untersucht, die als Sensorsignal den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen zwei Fluoreszenzproteinen ausnutzen. FRET-basierte Biosensoren zeigen ein großes Anwendungspotential in der Biotechnologie oder Diagnostik. Die Entwicklung hoch sensitiver Sensorkonstrukte wird jedoch durch das komplexe Sensordesign, sowie den begrenzten Informationsgehalt von Ensemblemessungen erschwert. In dieser Arbeit werden zunächst die experimentellen Voraussetzungen für eine Einzelmoleküldetektion von FRET-basierten Biosensoren diskutiert. Im Anschluss wird eine umfangreiche Einzelmolekülstudie einer Gruppe von Biosensoren für die Bestimmung von Glukosekonzentrationen vorgestellt. Dabei erlauben die Einzelmolekülinformationen eine detaillierte Unterscheidung verschiedener Parameter, die zusammen die Leistungsfähigkeit des jeweiligen Sensors festlegen. Diese Informationen ermöglichen nun ein zielgerichteteres Sensordesign. Des Weiteren wird der Effekt von makromolekularem Crowding auf den Glukosesensor sowie zwei spezifische Crowdingsensorkonstrukte auf dem Einzelmolekülniveau untersucht. Abschließend wird eine Einzelmolekülanalyse einer farbstoffmarkierten Nachbildung des Glukosesensors durchgeführt. Die geringe FRET-Änderung bei Glukosezugabe im Vergleich zum Sensor mit Fluoreszenzproteinen weist auf die Relevanz der relativen Fluorophororientierung bei der Entstehung des FRET-Signals hin, die nur bei Fluoreszenzproteinen auftritt. Der zweite Teil der Arbeit behandelt die Zweifarben-Koinzidenzdetektion (TCCD). Diese ermöglicht die Untersuchung der Bindung zweier Biomoleküle, die Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe aufweisen. Bestehende Methoden unterschätzen die Koinzidenz, da die Konfokalvolumina für die Detektion beider Farben unvollständig überlappen. Die Einführung einer Helligkeitsschwelle (BTCCD) für die Fluoreszenzintensität ermöglicht es, ausschließlich Molekültrajektorien auszuwählen, die beide Konfokalvolumina durchlaufen, was eine quantitative Koinzidenzanalyse erlaubt. Das Potential von BTCCD wird anhand der korrekten Reproduktion der Koinzidenz mehrerer, vollständig doppelt markierter Referenzproben dargelegt. Nach einer gründlichen Untersuchung der experimentellen Grenzen von BTCCD, wird die Methode zur Bestimmung der Anteile an Biosensoren, die ausschließlich einen fluoreszierenden Donor oder Akzeptor besitzen, angewendet. BTCCD wird schließlich zur Charakterisierung eines Systems zur zellfreien Proteinsynthese verwendet, sowie zum Nachweis eines zuvor unbeobachteten Initiierungsmodus der Proteintranslation in Bakterien. Die Möglichkeit der quantitativen Koinzidenzdetektion mit BTCCD sowie die Vielseitigkeit von Fluoreszenzassays machen BTCCD zu einem hilfreichen Werkzeug für zukünftige Studien zur Untersuchen der Wechselwirkung von Biomolekülen.