Confocal single molecule fluorescence detection - methodical developments and applications to biological specimens

Aachen (2017, 2018) [Doktorarbeit]

Seite(n): 1 Online-Ressource (xix, 130 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Kurzfassung

Immer wieder werden mit Hilfe von Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Messungen auf Einzelmolekülniveau wertvolle Erkenntnisse in den Bereichen der molekularen Konformationsdynamik, der Faltung und der Strukturaufklärung von biologischen Makromolekülen erlangt. Quantitativeund präzise Aussagen können dabei nur mittels einer genauen Kalibrierung der erhobenen Daten gewonnen werden, welche unterem anderen die Eigenschaften der als FRET-Paar eingesetzten Farbstoffe berücksichtigen muss. In dieser Arbeit werden zwei Methoden entwickelt und etabliert, die es ermöglichen die benötigte Farbstoffcharakterisierung mit einem Konfokalmikroskop durchzuführen, folglich können die betrachteten FRET Proben unter anwendungsnahen Bedingungen, d.h. nahe dem Einzelmolekülniveau vermessen werden. Zuerst wird der für die Berechnung des Förster Radius benötigte Orientierungsfaktor mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie Messungen abgeschätzt. Durch die in der Konfokalmikroskopie verwendeten Objektive mit hoher numerischer Apertur können dabei Depolarisationsartefakte auftreten, die durch zwei Korrekturfaktoren berücksichtigt werden müssen. Die präzise Bestimmung dieser Korrekturfaktoren wird in dieser Arbeit mit Hilfe der Kombination von theoretischen Vorhersagen mit einer erweiterten experimentellen, an das zeitliche Auflösungsvermögen des Systems angepassten Kalibrierungsprozedur erreicht. Um die Fluoreszenzquantenausbeuten von FRET Donor und Akzeptor zu bestimmen, die direkt in die Berechnung der FRET Effizienzen eingehen, wird die lineare Abhängigkeit der molekularen Helligkeit, zugänglich durch die Methode der Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie, von der Quantenausbeute im Grenzbereich kleiner Anregungsintensitäten ausgenutzt. Die darauf basierende Methode zur Quantenausbeutenbestimmung benötigt im Vergleich mit anderen häufig verwendeten optischen Verfahren nur einen Bruchteil (ca. drei Prozent) der Stoffmenge und ist dennoch mindestens genauso präzise. Durch ihre Sensibilität für dynamische und statische Fluoreszenzauslöschung ist die neu etablierte Methode zudem umfassender als andere Verfahren. Neben der Charakterisierung von Einzelmolekül FRET Proben ist sie generell zur Vermessung von (biologischen) Proben mit geringer Stoffmengenausbeute geeignet. Mit Hilfe der genannten methodischen Entwicklungen werden dann Einzelmolekül FRET Daten von strukturell rigiden, doppelsträngigen DNA Oligonukleotiden in reinem wässrigem Puffer und in Puffer mit bestimmten, hinzugegebenen Mengen von Glycerol, Guanidinhydrochlorid und Natriumchlorid analysiert. Es wird gezeigt, dass ohne die Korrektur von Solvens-induzierten photophysikalischen und spektralen Änderungen der fluoreszierenden Marker die berechneten Abstände zwischen Donor und Akzeptor-Farbstoff um bis zu 4 Å von den realen Abständen abweichen und zudem die zugrundeliegenden strukturellen Prozesse fehlinterpretiert werden. Zudem wird experimentell demonstriert und theoretisch untermauert, dass die elektrostatische Farbstoff-Farbstoff Repulsion für die betrachteten Abstände (> 50 Å) vernachlässigbar klein ist. Zuletzt werden alle methodischen Entwicklungen und experimentellen/theoretischen Resultate kombiniert um Erkenntnise über den schon entfalteten Zustand des Proteins Phosphoglyceratkinase in Abhängigkeit von der Denaturierungsmittelkonzentration zu gewinnen.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Kempe, Daryan

Gutachterinnen und Gutachter

Fitter, Jörg Ludwig
Wöll, Dominik

Identifikationsnummern

  • REPORT NUMBER: RWTH-2017-09658